Het spel werd in de eerste vier seizoenen door tien onbekende Nederlanders gespeeld (alleen in seizoen 3 deden er elf kandidaten mee); sinds seizoen 5 wordt het door tien bekende Nederlanders gespeeld. De kandidaten reizen naar het buitenland, waar ze allerlei opdrachten moeten uitvoeren. Deze bestemmingen wisselen per seizoen en in de periode dat het programma loopt, zijn inmiddels alle continenten bezocht (met uitzondering van
Antarctica).
De kandidaten moeten samenwerken om de opdrachten zo goed mogelijk uit te voeren en geld te verdienen voor de pot. Maar één van hen is een bedrieger, een mol, en die heeft als opdracht om de opdrachten te saboteren. De mol moet dit doen zonder dat de anderen dit doorhebben.
Na elke ronde (elke twee/drie dagen) krijgen de kandidaten twintig vragen (in de finale veertig vragen) over de identiteit van de mol. Degene die de minste goede antwoorden geeft(rood scherm), ligt uit het spel en gaat direct naar huis. Bij gelijkspel wordt gekeken wie het snelst was. Er is de kandidaten alles aan gelegen om zo veel mogelijk informatie over de anderen in te winnen, vooral over diegene waarvan zij vermoeden dat die de mol is. Het kan ook slim zijn van een kandidaat om zichzelf verdacht te maken, zodat de anderen op hem als mol stemmen. Ook kunnen de kandidaten sinds seizoen zes jokers verdienen; voor elke joker die men inzet, wordt een fout beantwoorde vraag toch goed geteld. In sommige afleveringen kunnen de kandidaten vrijstellingen verdienen, waardoor ze niet mee hoeven te doen met de test en dus niet kunnen afvallen. Het eigenbelang kan daardoor behoorlijk conflicteren met het groepsbelang. In het veertiende seizoen van het programma werd de Zwarte Vrijstelling geïntroduceerd. Als deze wordt ingezet, worden daarmee alle ingezette jokers en vrijstellingen ongedaan gemaakt.
Uiteindelijk blijven er drie kandidaten in de finale over (alleen in seizoen 7 waren dit er vier). Eén wint, één verliest en de derde is de mol. De kandidaat die in de finale de test het beste maakt, wint Wie is de Mol? en daarmee de pot met het geld.
